O microscópio é um equipamento que se utiliza da luz para produzir um aumento no tamanho de um elemento de difícil visualização a olho nu, utilizado principalmente para estudos, análises e pesquisas. É o instrumento mais antigo e básico para o estudo dos microrganismos e, desde que foi inventado, evoluiu junto com as inovações tecnológicas que surgiram ao longo da história, gerando diversos tipos de microscopia que são utilizados para diferentes finalidades na área de microbiologia e biologia celular.
1. Microscópio ótico
Este é o tipo mais básico de microscópio, no qual um feixe de luz visível é direcionado através de uma série de lentes de vidro curvo para o objeto ou microrganismo a ser observado. As partes mais importantes do microscópio são as lentes que são empilhadas dentro de cilindros metálicos conhecidos como objetivas, por onde passa a luz gerada por uma lâmpada e é direcionada para as oculares, onde estão localizados os olhos do observador, que controla o foco com alguns botões localizados na lateral do aparelho.
A estrutura das lentes faz com que a luz se dobre de tal forma que amplie a imagem quantas vezes as próprias lentes permitirem. Embora pareça simples, há limitações que dependem das propriedades físicas da luz por isso existem diferentes técnicas e modificações que servem para melhorar a qualidade da imagem. Para entender isso, deve-se ter em mente o conceito de resolução, que é a capacidade de identificar dois objetos que estão juntos como distintos e independentes. Em geral, o limite de resolução de um microscópio de luz é de 0,2 µm. Por outro lado, a ampliação é o número de vezes que o tamanho de uma imagem aumenta, e a ampliação total de um microscópio é o resultado do produto da ampliação das lentes que a compõem.
Ampliação e resolução devem ser equilibradas para ter uma imagem. Qualidade aumentada em até 2000 vezes, e isso é indicado pela abertura numérica, característica da lente que é função da capacidade de captar o comprimento de onda da utilizada, quanto mais ampliação tiver uma lente, maior deve ser sua abertura numérica ser. Em biologia, são utilizados microscópios cujas objetivas e oculares, juntas, atingem cerca de 2.000 aumentos.
Colorações
Para melhorar a imagem em microscópios ópticos, se melhora o contraste por meio do uso de corantes orgânicos de acordo com o que se deseja observar. Isso permite diferenciar diferentes tipos de bactérias ou destacar algumas estruturas internas ou externas das células.
Alguns dos corantes mais amplamente utilizados são o azul de metileno, a violeta genciana e a safranina que, tendo carga positiva, se ligam por afinidade a estruturas celulares carregadas negativamente, como ácidos nucléicos e polissacarídeos ácidos.
A coloração de Gram é um processo muito importante em microbiologia, cujo resultado permite diferenciar entre bactérias Gram-positivas (roxo) e Gram-negativas (rosa); de acordo com a estrutura da parede celular. Este é um procedimento básico para caracterizar bactérias recém-isoladas.
Contraste de fases e campo escuro
Embora os corantes sejam amplamente utilizados, eles matam as células e alteram suas características. No entanto, existem técnicas que aumentam o contraste sem cora-las, mantendo-as vivas. O contraste de fase é uma dessas técnicas e baseia-se no princípio de que as células têm um índice de refração diferente do meio circundante. A refração é uma propriedade que faz com que a luz passe lentamente por um material, então, colocando um anel de fase na objetiva, gera-se uma imagem escura com um fundo claro com maior contraste, aproveitando essa propriedade.
Por outro lado, o campo escuro consiste em aproveitar apenas a luz que espalha a amostra, de forma que uma imagem nítida seja observada em um fundo escuro. Esta técnica tem maior resolução e contraste, permitindo observar estruturas de difícil visualização em outros tipos de microscopia.
Microscopia de Fluorescência
A microscopia de fluorescência é aplicada para observar amostras capazes de emitir luz de cor diferente da luz que estão absorvendo, ou seja, emitem fluorescência. É usado para amostras que contêm substâncias fluorescentes naturais como a clorofila ou que se coram com componentes fluorescentes como DAPI (4´,6-diamidino-2-fenillindol) um componente que forma complexos fluorescentes com o DNA de células em amostras de solo, água e alimentos, pelo qual é uma ferramenta no diagnóstico clínico e para estudos de ecologia microbiana.
Microscopia de Contraste de Interferência Diferencial
Os microscópios com essa tecnologia permitem observar a estrutura interna das células por meio do uso de um polarizador de luz montado no condensador, que direciona a luz polarizada para um prisma que gera dois feixes de luz que passam pela amostra e depois se reencontram na objetiva com diferentes índices de refração. Essa interferência faz com que a amostra adquira uma aparência tridimensional, dando relevo ao interior da célula, permitindo ver núcleos de células eucarióticas ou endósporos e inclusões em células bacterianas.
É um dispositivo controlado por computador no qual um laser acoplado a um microscópio gera imagens tridimensionais da amostra com diferentes planos de foco. Essa tecnologia permite observar células com superfícies espessas, como a superfície de um biofilme bacteriano, onde podem ser vistas células crescendo sobre ele. Além disso, eles podem ser coloridos digitalmente e reconstruídos para obter imagens tridimensionais completas de amostras de ecologia microbiana, entre outras.
Nesses microscópios, feixes de elétrons são usados em vez de luz visível para gerar imagens de células e suas estruturas. Na biologia, se usam a microscopia eletrônica de transmissão e de varredura.
Microscopia eletrônica de transmissão
É um tipo de microscopia com alto poder de resolução. Isso se deve ao fato de que o comprimento de onda dos elétrons é menor do que o da luz visível, que, ao colidir com a amostra, gera uma imagem digital com detalhes tão finos que é possível observar moléculas tão pequenas quanto uma proteína individual.
Microscopia eletrônica de varredura
Com esta tecnologia, imagens tridimensionais podem ser recriadas. Para fazer isso, a amostra deve ser finamente coberta com uma camada de metal pesado, que é submetida ao feixe de elétrons que passa várias vezes pela amostra. Desta forma, os elétrons são desviados e coletados por um sensor que reconstrói digitalmente a imagem e com um dos maiores valores de resolução e ampliação, até 100.000 vezes de ampliação.
Imagem: Fotolia. science
Artigo de: Rodrigo Arredondo Fernández. Graduado em Biologia pela UNAM. Experiência em pesquisas sobre microbiologia de alimentos fermentados tradicionais.
Referencia autoral (APA): Arredondo Fernández, R.. (Maio 2023). Conceito de Microscópio. Editora Conceitos. Em https://conceitos.com/microscopio/. São Paulo, Brasil.
